火狐体育首页进入:激光显微切开——空间肿瘤组学研讨的利器

　　当今社会，肿瘤因其高发病率和高死亡率成为要挟人类健康的重要疾病，肿瘤细胞在演进进程中因为细胞的方位、功用、骤变以及mRNA的表达不同导致肿瘤安排具有很高的异质性，在进行基因组和蛋白组剖析之前，需要对肿瘤安排的特定细胞群或许单个细胞进行搜集，因而怎么从成分杂乱的安排中取得单一的细胞群成为肿瘤研讨中亟待处理的问题。2020年，德国弗里德里希·席勒—耶拿大学的Franziska Hoffmann教授和Ferdinand von Eggeling博士在世界闻名期刊Proteomics杂志上协作宣布了题为“Microdissection -- An Essential Prerequisite for Spatial Cancer Omics“[1]的封面总述文章，提出将激光显微切开技能运用于肿瘤多组学研讨中，这儿为我们解读一下这篇文章。

　　激光捕获显微切开（laser capture microdissection, LCM）技能是于20世纪90年代末由美国国立研讨院开发的一项新技能。LCM技能能够在显微镜直视下从器官或安排切片中精确获取某个特定的细胞群或单个细胞，它的呈现使处理肿瘤异质性这一难题成为或许。跟着二代测序和多组学技能的开展，LCM技能作为同质化样本的重要获取手法，已成为肿瘤基础研讨中的支撑技能。

　　LCM技能是在显着镜直视下运用激光将安排切片中特定区域的细胞切开并搜集起来，现在市场上主要有四种类型的LCM体系，它们的根本作业原理类似，仅仅样本的搜集办法略有不同，表1总结了四种LCM体系的特色及优势。以蔡司的Palm microBeam为例，先运用355nm的紫外激光在倒置的显微镜下对样本进行切开，切开时样品移动，而激光束不动，然后确保激光束一直聚集在切开平面；待切开完成后，发射一个激光脉冲，使切下的小块安排向上弹射、进入搜集设备。整个进程简略，没有任何机械触摸，无污染、无热损害，不需要特别耗材，并且支撑在一般拨片上进行切开。

　　比较于传统的细胞获取办法，LCM技能具有显着的优势：样品来历广泛，一起适用于固定白腊包埋的（FFPE）安排切片和冷冻切片；此外，部分体系还支撑活细胞和染色体的切开，捕获效率高，操作简略，用户只需在显微镜调查下运用鼠标在显示屏上挑选要切开的规模；并且LCM是以高能量激光进行切开，防止直触摸摸样品带来的外界污染，一起激光发生的热量会被瞬时冷却，不会损坏靶细胞内的DNA与蛋白质等大分子，这关于下流基因组学和蛋白质组学的剖析极为重要。

　　为了使待切开样天性坚持安排的原始形状，在切开前一般需要对安排进行固定，常用的固定办法有两种：一种是运用的白腊包埋、固定，另一种是低温冷冻。白腊包埋需历经脱水、通明、浸蜡、包埋等多个过程，该办法较繁琐、耗时长，且或许构成萃取物的丢失，并会损坏安排中DNA、RNA、蛋白质等大分子的结构。它的长处在于白腊的固定效果能较好地坚持细胞形状，构成的图画明晰、有利于调查，并且FFPE具有很多的样本来历，故此，仍有不少研讨人员将它作为动植物安排切片的制备技能。而冷冻切片法在LCM中的运用频率越来越高，它具有操作快捷、试验周期短、污染小、温度可调等特色，有利于确保安排中大分子结构的完整性；操作时仅需将新鲜或固定好的资料嵌入安排冷冻包埋剂中，快速冷冻后即可切片。关于一些含水量较大的植物安排，样品在冷冻进程中往往会构成很多的冰晶，然后损坏细胞结构。近年来跟着冷冻保护剂和超低温速冻法的运用，该状况得到了显着的改进。

　　近年来，跟着微量RNA提取、单细胞全基因组扩增等分子生物学技能的开展，LCM结合二代测序（NGS）、双向凝胶电泳（2-DE）、质谱等技能在肿瘤基因组学、蛋白质组学、代谢组学中展示出了巨大的潜力。

　　质谱法是多组学研讨中开展最快、最具生机和潜力的技能，现在，常用的质谱技能主要有两种：电喷雾质谱（ESI-MS/MS）和基质辅佐激光解析/电离飞翔时间质谱（MALDI-TOF-MS）。布鲁克在2019年推出了依据timsTOF fleX的空间定位组学计划，将LCM与MALDI成像和ESI-MS/MS结合在一起。MALDI质谱作为一种新的分子成像技能，近年来在多组学研讨中发挥了巨大的潜力，它无需符号、灵敏度高、分子特异性强，能一次从安排标本中一起检测上千种生物分子，供给其他技能无法取得空间散布信息。经过timsTOF fleX MALDI成像能够得到分子在整个安排的空间散布状况，然后能够将高表达的区域或许具有类似分子组成的区域作为方针微区（ROI）进行激光微切开，再将微切开的样本进行LC-MS/MS深度的多组学剖析。与传统的“全体匀浆办法”比较，依据LCM的MALDI成像充分地考虑到癌安排中不同的肿瘤亚细胞群之间的差异性，并分别对肿瘤不同细胞集体进行了有针对性的深度多组学剖析。

　　LCM与多组学技能的结合会发生巨大且杂乱的多维数据集，远远超过了传统数据处理办法的领域，因而LCM在多组学运用最大的应战便是ROI的挑选、安排的重构以及微切开后的判定。在布鲁克空间定位组学计划中，收集的多维MSI数据能够经过深度学习的算法得到相应的监督式或非监督式的分子特征，然后构建猜测模型，最终将细胞或安排依据分子组成差异划分为若干区域，完成ROI的自动化挑选；另一方面，ROI的坐标信息能够直接传输到蔡司和徕卡LCM体系中，完成精准切开。

　　LCM技能的呈现，使研讨人员能从肿瘤安排中获取特定的细胞（或细胞簇）。将它与布鲁克的timsTOF fleX质谱仪联合运用，即可完成“MALDI成像的精确定位——LCM对特定细胞区域的精准收集——对所收集区域的4D-多组学深度剖析”的空间肿瘤组学作业流程。该流程成功地处理了肿瘤安排的异质性问题，并将进一步推进肿瘤发生开展机制和肿瘤标志物筛查等方面的研讨作业。

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